立 HPLC 之法

系建高效液相層析法：模擇、柱化、流相與梯設、流與溫優、檢擇、迭代改進，為非揮、熱不穩、或極性分析物於液或複基質。

用

• 析非揮、熱不穩或過極（不宜 GC）之物
• 從始建 HPLC-UV、HPLC-螢光、或 LC-MS 法
• 改文獻或藥典 HPLC 法至異柱或儀
• 改分辨差、運時長、或靈敏不足之舊法
• 擇合適層析模（反相、HILIC、離子交換、SEC、手性）

入

必

• 目分析物：名、結構、分子量、pKa、logP/logD
• 樣基質：劑、生液、環萃、或淨液
• 效標：分辨、檢限、定量域

可

• 參考法：藥典或文獻法為起
• 可用柱：HPLC 柱錄
• 儀配：UHPLC vs 常 HPLC、可用檢、柱爐域
• 通量求：含再平衡之最長運時
• 規約：ICH、USP、EPA 或他合規

行

一：定分離標

1. 集分析物性：分子量、pKa、logP（或某 pH 下 logD）、發色、螢光、可離基
2. 識樣基質與預干擾（賦形、內源、降解物）
3. 定效：
   • 關鍵對分辨（規範法 Rs >= 2.0）
   • 檢限（LOD/LOQ）
   • 含梯再平衡之可接運時
4. 斷法為定量、雜析、溶出、均勻、清潔驗—此導驗類
5. 擇等度 vs 梯：諸分析物在 2 < k' < 10 之留因域→等度；否則梯

得：規格書，列分析物及物化性、基質述、效標、等度 vs 梯決。

敗：pKa 或 logP 未知→由結構以工具（ChemAxon、ACD/Labs）估，或於 C18 柱 pH 3、7 運探梯以驗留行。

二：擇柱化

依分析物性擇層析模與柱。

1. logP > 0 之小分子→反相 C18 為默認
2. logP < 0→評 HILIC 或離子交換
3. 擇粒徑：UHPLC 小於 2 um（高效、高背壓）；常 HPLC 3-5 um
4. 擇柱尺：長 50-150 mm，ID 2.1-4.6 mm。窄柱省溶並增 MS 靈敏
5. 手性分離→篩至少 3-4 異選擇基之手性固定相

得：柱化、尺、粒徑已擇並由分析物性證。

敗：初探於 C18 留差→換更留之相（芳香→phenyl-hexyl）或異模（極性→HILIC）。

三：設流相及梯

1. 擇有機改質：
   • 乙腈（ACN）：黏低、峰銳、UV 穿透（< 210 nm）
   • 甲醇（MeOH）：異選擇、時宜極性析物、黏較高
2. 擇水相及 pH：
   • 中性析物：水+0.1% 甲酸（MS 相容）或磷酸緩（僅 UV）
   • 可離析物：緩流相於析物 pKa 之外 2 pH 單位以保單離形
   • pH 2-3（甲／磷酸）：抑酸離，良通用起
   • pH 6-8（甲／乙酸銨）：鹼析或低 pH 選擇不足
   • pH 9-11（碳酸氫銨、BEH 柱）：極鹼於高 pH 穩柱
3. 設梯：
   • 始 5-10% 有機，10-20 分升至 90-95% 為初探
   • 評探層析以識有用有機域
   • 窄梯至僅涵興趣洗脫窗
   • 梯坡：陡→速但分辨低；緩→分辨佳但運長
4. 含柱洗（95% 有機 2-3 分）及再平衡（初條件 5-10 柱體積）
5. 等度法→目標分析物 k' = 3-8

得：流相組（有機、水、緩／添、pH）及梯廓已定，探行確認析物洗脫於程窗內。

敗：選擇差（梯優後仍共洗脫）→換有機（ACN 與 MeOH 互換）、調 pH 2 單位、或為荷析物加離子對試。

四：優流率及溫

1. 依柱尺設初流率：
   • 4.6 mm ID：1.0 mL/分
   • 3.0 mm ID：0.4-0.6 mL/分
   • 2.1 mm ID：0.2-0.4 mL/分
2. 驗背壓在儀與柱限內（常 < 400 bar 常、< 1200 bar UHPLC）
3. 優柱溫：
   • 始 30 C 以重現（避環波）
   • 升至 40-60 C 以減黏、降背壓、銳峰
   • 手性柱溫常強影對映選擇→篩 15-45 C
4. 評流率對分辨之影：小增流可增通量而少損分辨，若近 van Deemter 谷
5. 記最佳流率、柱溫、所致背壓

得：流率與柱溫已優，背壓在限內，分辨維持或勝初條件。

敗：背壓過高→減流、增溫、或換寬徑或大粒柱。高溫降分辨→返 30 C 受較長運時。

五：擇檢

1. 有 UV 發色基（芳、共軛）之析物→始 DAD—供定量及峰純
2. 複基質痕量→用 MS（ESI、APCI）於 SIM 或 MRM
3. 無發色（糖、脂、聚）→CAD、ELSD 或 RI
4. 檢波於析物吸收峰（lambda-max）最靈敏，或 210-220 nm 為通篩
5. 螢光→以析物光譜掃描優激／發波
6. 流相添加宜相容：MS 勿用磷酸緩，低波勿用 UV 吸收添

得：檢已擇並設（波、增益、取率）合析物化學與靈敏。

敗：UV 靈敏不足於所需 LOQ→考螢光衍生（胺用 OPA、胺酸用 FMOC）或換 LC-MS/MS 為最高靈敏選擇。

六：評並改

1. 進系統適用標 6 次並評：
   • 留時 RSD < 1.0%
   • 峰面 RSD < 2.0%
   • 關鍵對分辨 >= 2.0
   • 諸峰拖因 0.8-1.5
   • 塔數符柱規
2. 進安慰劑／基質空白以查析物留時之干擾
3. 進應激或添樣以驗法能分降解物與主析物
4. 某標不過→一次調一變：
   • 分辨差：變 pH、梯坡、或柱化
   • 拖尾：加胺改質（鹼析用 TEA）、變緩、或換鍵相
   • 靈敏：增進量、濃樣、或換檢
5. 鎖末法參並書諸條件

得：諸系統適用標過；法分目析物與基質干擾及已知降解；參已書以轉。

敗：迭調不能解→考根本異策（換層析模、2D-LC、或衍生）並返步二。

驗

• 諸目析物分離，關鍵對 Rs >= 2.0
• 6 次重複留時 RSD < 1.0%
• 6 次重複峰面 RSD < 2.0%
• 諸析物峰拖因 0.8-1.5
• 析物留時無基質干擾
• 降解物與主析物分
• 含再平衡之運時符通量
• 流相相容所擇檢
• 法參盡書（柱、流相、梯、流、溫、檢）

忌

• 略可離析物之流相 pH：近 pKa 運行致峰裂或重現差（兩離形）→緩於 pKa 外至少 2 pH 單位
• MS 用磷酸緩：磷非揮污 MS 源→LC-MS 用甲酸或乙酸緩
• 梯後再平衡不足：柱宜以初流相至少 5-10 柱體積沖→再平衡不足致留時漂
• 複合用過短柱：短柱（50 mm）快但塔不足於多組分分離→法建始 100-150 mm
• 略系死體積：死體積（混至柱頭）延梯達柱→儀異致法轉失敗→宜測並書
• 以反相之法運 HILIC：HILIC 宜高有機（80-95% ACN）加少水→增水增洗脫強→與 RP 反。平衡時亦更長

參

• develop-gc-method
• interpret-chromatogram
• troubleshoot-separation
• validate-analytical-method